Tema: Desarrollo de un ensayo de RT-PCR en tiempo real para la detección rápida de virus de influenza A (H2)
Objetivo: Diseñar cebadores y sondas de oligonucleótidos para la detección rápida del subtipo H2 del virus de la gripe mediante la transcripción reversa en tiempo real - reacción en cadena de la polimerasa (rRT-PCR).
Muestra Biológica: Muestras de torundas nasales de cerdos
Tipo de ácido nucleico: ADN genómico
Gen a amplificar: Gen que codifica para la HA
Tipo de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Pasos:
La especificidad analítica
La sensibilidad analítica de conjuntos seleccionados de cebadores y sondas se evaluó en una amplia gama de cepas de influenza y virus respiratorios distintos de la influenza. Se encontró que el conjunto H2-2 tiene una especificidad insuficiente para detectar virus de influenza A estacional (H1N1) y fue excluido de un análisis posterior.
La sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica se ensayó adicionalmente en la cepa vacunal A / 17 / California / 66/395 (H2N2) y A / Japón / 305/1957 (H2N2), el límite de detección para los cebadores-sonda fue de 3,2 (IC95%: 3,07). -3.48) lg EID50 / ml. Los cebadores y sondas diseñados para la detección universal de RT-PCR en tiempo real de virus de influenza A (H2) podrían usarse en ensayos clínicos de vacunas contra influenza A (H2) y detección de H2 en casos de influenza A no insustituible en humanos.
Netgrafía:
NCBI.Development of a realtime RT-PCR assay for the rapid detection of influenza A(H2) viruses. [Internet], disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28652020
Objetivo: Diseñar cebadores y sondas de oligonucleótidos para la detección rápida del subtipo H2 del virus de la gripe mediante la transcripción reversa en tiempo real - reacción en cadena de la polimerasa (rRT-PCR).
Muestra Biológica: Muestras de torundas nasales de cerdos
Tipo de ácido nucleico: ADN genómico
Gen a amplificar: Gen que codifica para la HA
Tipo de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Pasos:
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es ADN complementario (cADN) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
- Transcripción reversa: Unión del partidor a la secuencia de ARN objetivo.
- Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del partidor mediante la incorporación de nucleótidos complementarios.
- Fin de transcripción reversa: Se obtiene la hebra del cADN complementario al ARN
- Desnaturalización: 95 °C por un minuto
- Anillamiento: 54 °C por varios segundos
- Extención: 72° C a 2 minutos
La especificidad analítica
La sensibilidad analítica de conjuntos seleccionados de cebadores y sondas se evaluó en una amplia gama de cepas de influenza y virus respiratorios distintos de la influenza. Se encontró que el conjunto H2-2 tiene una especificidad insuficiente para detectar virus de influenza A estacional (H1N1) y fue excluido de un análisis posterior.
La sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica se ensayó adicionalmente en la cepa vacunal A / 17 / California / 66/395 (H2N2) y A / Japón / 305/1957 (H2N2), el límite de detección para los cebadores-sonda fue de 3,2 (IC95%: 3,07). -3.48) lg EID50 / ml. Los cebadores y sondas diseñados para la detección universal de RT-PCR en tiempo real de virus de influenza A (H2) podrían usarse en ensayos clínicos de vacunas contra influenza A (H2) y detección de H2 en casos de influenza A no insustituible en humanos.
Netgrafía:
NCBI.Development of a realtime RT-PCR assay for the rapid detection of influenza A(H2) viruses. [Internet], disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28652020
